为什么 Taq 会加 A 尾？

Taq 聚合酶具有末端转移酶活性，会在多数产物 3′ 端加一个非模板的 dA。高保真聚合酶不会，其产物需先加 A 尾。

高保真酶的产物能做 TA 克隆吗？

不能直接做。平末端产物需先用 Taq 与 dATP 加 A 尾，或改用平末端/无缝克隆。

TA 用 DNA 连接酶连接 A/T 突出端，需数分钟到数小时；TOPO 用结合在载体上的拓扑异构酶 I，约 5 分钟完成，但需要专用载体系统。

TA 克隆没有方向性 —— 两个方向概率相近，需要用菌落 PCR 或酶切筛选。TOPO 定向载体可以避免这个问题。

把 Taq 扩增的 PCR 产物克隆进 T 载体或 TOPO 载体，并得到所得质粒序列。

模式同源臂越长重组效率越高，但合成成本也越高。

载体（已线性化）

0 bp

插入片段 / PCR 产物

0 bp

载体与插入片段序列都需要填写。

选择 TA 或 TOPO 模式，粘贴线性化载体与 PCR 产物，工具按各自化学会引入的碱基给出克隆序列。

TA 克隆：粘贴线性 T 载体与带 A 尾的 PCR 产物。TOPO：粘贴 TOPO 载体与带 5′ CACC 延伸的产物。

TA 克隆利用 Taq 聚合酶的末端转移酶活性 —— 它会给多数 PCR 产物的 3′ 端加一个 A。带互补 3′ T 突出的线性载体即可与之连接，全程不需要酶切位点。TOPO 克隆则用已经共价结合在载体末端的拓扑异构酶 I 取代连接酶。

TA 模式下产物按 T + 插入片段 + A + 载体构造，还原两处接缝各加的一个碱基。TOPO 模式下载体的 CCCTT 突出与插入片段的 5′ CACC 延伸及 3′ GTGG 配对，产物为 CACC + 插入片段 + GTGG + 载体。两者都会在接缝留下少量碱基，设计编码序列时要算进去。

1.0 kb 的 Taq 产物克隆进 3.0 kb T 载体，得到 4.0 kb 质粒外加两个接缝碱基。切到 TOPO 模式则改为加上 CACC/GTGG 这四碱基对，而这正是 TOPO 表达系统里决定读框的地方。

适合快速克隆筛选用 PCR 产物、对非高保真扩增子做 TA 克隆，以及在订购前确认 TOPO 载体到底会给最终构建贡献哪些序列。

为什么 Taq 会加 A 尾？: Taq 聚合酶具有末端转移酶活性，会在多数产物 3′ 端加一个非模板的 dA。高保真聚合酶不会，其产物需先加 A 尾。
高保真酶的产物能做 TA 克隆吗？: 不能直接做。平末端产物需先用 Taq 与 dATP 加 A 尾，或改用平末端/无缝克隆。
TA 与 TOPO 有何区别？: TA 用 DNA 连接酶连接 A/T 突出端，需数分钟到数小时；TOPO 用结合在载体上的拓扑异构酶 I，约 5 分钟完成，但需要专用载体系统。
插入片段会是哪个方向？: TA 克隆没有方向性 —— 两个方向概率相近，需要用菌落 PCR 或酶切筛选。TOPO 定向载体可以避免这个问题。