In-silico PCR 工具
在自己的模板上模拟 PCR —— 列出一对引物能扩出的全部产物，含错配数与特异性判定。
0 bp
0 nt
0 nt
允许错配才能找出近似结合位点 —— 这正是胶上杂带的来源。
需要模板与两条引物。
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功能简介
In-silico PCR 回答的是胶图回答得太晚的那个问题：这对引物在这条模板上究竟会扩出什么？工具不假设只有一个产物，而是枚举长度窗口内所有正向/反向位点组合，逐个给出坐标、长度与错配数。
原理与公式
每条引物都在模板上扫描；反向引物按其在顶链上的反向互补匹配。每个正向位点与下游每个反向位点配对形成产物。两条引物都完全匹配的产物即预期扩增子，其余为潜在杂带。默认要求 3′ 末端 5 个碱基完全匹配 —— 那里的错配通常会让延伸直接失败。
演算示例
在 900 bp 质粒上用 22 nt 正向与 24 nt 反向引物，得到唯一一条 524 bp 完全匹配产物，判定为「特异」。允许两个错配后可能出现第二条 1.7 kb 产物 —— 那正是原本会被你归咎于聚合酶的杂带。
适用场景
适合订购前检查新引物对、反应后解释异常条带、以及确认引物对不会扩增空载体。它只检索你给的模板 —— 要评估全基因组特异性仍需对该物种做 BLAST。
常见问题
- 这和 Primer-BLAST 一样吗？
- 不一样。Primer-BLAST 检索物种基因组数据库，本工具只检索你粘贴的模板。它回答的是「这管里会发生什么」，而非「这个基因组里会发生什么」。
- 为什么会看到带错配的产物？
- 因为引物也会不完全结合，退火温度低时尤其明显。这些就是胶上会出现的杂带。
- 3′ 端必须匹配这条约束有什么用？
- 它要求引物最末 5 个碱基完全配对。延伸从 3′ 端开始，那里的错配通常会导致完全扩不出来。
- 质粒模板该设为环状吗？
- 完整质粒应选环状 —— 引物对可以跨起点扩增。PCR 产物或线性化片段则选线性。