引物质检工具
检查引物的发夹与二聚体，在模板上扫描非特异结合位点，并列出引物对可能扩出的全部产物。
填入后可检测两条引物之间是否形成交叉二聚体。
只有填了模板，才会扫描非特异结合位点与错配数。
按首尾相连处理，跨起点的结合位点与产物都会算进来。
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功能简介
序列上看起来没问题的引物，到实验台上仍可能失败。其中两个原因占了大多数：二级结构挡住了引物退火，以及非特异结合把反应带到了错误的模板上。这个工具在花钱合成之前先把这两类问题查一遍。
原理与公式
共四项独立检查。发夹检测寻找由 4 个以上互补碱基组成的茎、以及 3–8 nt 的环，并给出茎长与环长。二聚体检测寻找你的引物与配对引物之间 4 个以上碱基的 3' 端互补重叠——正是这种构型会阻断聚合酶延伸。提供模板后，引物及其反向互补序列会逐位扫描，包含环状序列的首尾衔接，统计错配数，并单独记录落在 3' 末端五个碱基内的错配数。一个完全匹配位点外加一个含一两位错配的位点，正是「会出背景带」的典型特征。第四项检查针对的是「引物对」而不是单条引物：把两条引物各自在模板的每个位置退火，枚举所有朝向彼此、能构成产物的组合。只出一条完全匹配的产物说明反应干净；第二条由错配位点组成的产物，就是「杂带」在序列层面的对应物；而出现多条完全匹配产物，说明这条模板区分不开你的引物对。
演算示例
点「加载示例」：引物 5'-CACGCACCTAACAGTCTAAG-3'，配对引物 5'-GTAACTCGCTAGGTTGGGTA-3'，模板 750 bp。两条引物的 Tm 都是 59.5 °C、GC 50%，均未检出发夹，彼此之间也无 3' 端重叠。对模板扫描时，正向引物在位置 78 有唯一的完全匹配位点，反向引物在位置 401 有一个，两者构成唯一的 343 bp 产物、没有竞争位点——这就是一对干净、特异的引物该有的样子。
适用场景
下单前跑一遍，尤其是那些从别处设计来、或者沿袭自旧实验方案的引物。它也是诊断「PCR 出现多余条带」最快的办法：把错配容差设为 2，看引物是否存在第二个结合位点。同一个检查还能抓出只在引物浓度偏高时才出现的二聚体。
常见问题
- 引物质检具体检查什么？
- 四项内容：发夹结构（4 个以上互补碱基的茎配 3–8 nt 的环）、引物二聚体（两条引物 3' 端 4 个以上互补碱基的重叠）、在你提供模板时扫描所有落在错配容差内的结合位点，以及两条引物都填好后，列出这一对在模板上可能扩出的全部产物。
- 发夹和二聚体哪个更糟？
- 通常是 3' 端二聚体更糟。发夹在退火过程中还有机会解开，而 3' 端二聚体会直接阻断聚合酶延伸，并且引物浓度越高问题越严重。
- 错配数该设多少？
- 2 是实用的默认值：能抓出多数非特异产物，结果列表又不会太长。用 0 只找预期结合位点，用 3 则是对特异性做悲观估计。
- 工具说引物没问题，就一定能用吗？
- 不能。这些检查覆盖二级结构，以及在你粘贴的这条模板上的结合位点与「这一对可能扩出的全部产物」——包括由错配位点组成的产物，那正是出现杂带的来源。但它无法检索整个基因组或序列数据库，无法预测模板自身二级结构与高 GC 扩增困难，基因组层面的非特异位点仍然需要做 BLAST。