引物 Tm 计算器
计算 DNA 引物的熔解温度（Tm）。
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功能简介
引物 Tm 计算器用两种独立规则估算 DNA 寡核苷酸的熔解温度，并同时给出 GC 含量、长度和分子量。Tm 是双链解离一半时的温度，它决定 PCR 程序的退火步骤温度，也决定杂交实验洗涤的严谨度。工具仅统计 A、C、G、T，因此修饰位点和简并碱基不计入估算。
原理与公式
工具给出两个公式的结果。Wallace 法则为 Tm = 2 ×（A + T）+ 4 ×（G + C），每个 A 或 T 计 2 °C，每个 G 或 C 计 4 °C；计算快捷，对常规盐浓度下约 14–20 nt 的短引物较为适用。盐校正公式为 Tm = 64.9 + 41 ×（G + C − 16.4）/ N，其中 N 为引物长度，它按 GC 比例而非绝对计数缩放，引物较长时表现更好。两个公式都不考虑序列上下文、引物浓度和镁离子，因此对设计要求较高的场合，采用最近邻热力学模型（对每一相邻碱基对累加堆积焓与熵）会更准确。分子量按单链中各核苷酸残基质量计算，是把微克级合成量换算为纳摩尔时所需的数据。
演算示例
以 20 nt 引物 5'-ATGCGGATCCATGCTAAGGT-3' 为例：A = 5、T = 5、G = 6、C = 4，故 G + C = 10，GC 含量为 50%。Wallace 法则得 Tm = 2 × 10 + 4 × 10 = 60.0 °C；盐校正公式得 64.9 + 41 ×（10 − 16.4）/ 20 = 51.8 °C；分子量约为 6157 道尔顿。相差 8 °C 恰好提醒我们这些都只是估算值：对 20 nt 引物而言，盐校正值通常更可信，而围绕该值做梯度 PCR 则能通过实验给出定论。
适用场景
编写 PCR 程序时，先算出两条引物的 Tm，把退火温度设在较低那个 Tm 以下几度。设计引物对时，通过调整引物长度或位置，使两者 Tm 差异控制在约 5 °C 以内，否则 Tm 失配会让一条引物占据主导并产生非特异产物。设计探针或嵌套引物、需要让其中一条先结合而另一条暂不结合时，比较 Tm 可确认反应降温过程中的结合先后顺序。
常见问题
- PCR 引物的 Tm 多少比较合适？
- 多数引物按 55–65 °C 的 Tm 来设计，这样退火温度可以明显高于非特异产物形成的温度，同时又在常规聚合酶的工作区间内。同样重要的是，一对引物的 Tm 应相差在约 5 °C 以内，使两条引物能在同一循环中高效退火。
- 为什么 Wallace 法则和盐校正公式的 Tm 不一样？
- 两者是针对不同情形拟合的近似公式。Wallace 法则按每个碱基叠加固定贡献，随引物变长会无限增大，因此对超过约 20 nt 的寡核苷酸会高估 Tm；盐校正公式使用 GC 比例并带有长度项，结果更贴近实际。可把两个数值视为一个区间，如差异影响实验则通过实验验证。
- 25 nt 的引物该用哪个 Tm 公式？
- 建议采用盐校正值，而不是为更短寡核苷酸校准的 Wallace 法则——后者在 25 nt 时会偏高。对必须依赖的关键引物，使用能够考虑序列上下文、盐浓度与引物浓度的最近邻算法更为可靠，而梯度 PCR 始终是最终的判定手段。
- Tm 会受盐浓度和引物浓度影响吗？
- 会。较高的一价盐和镁离子会屏蔽磷酸骨架的负电荷、稳定双链，因此 Tm 随离子强度升高而升高，这正是盐校正公式试图刻画的效应。由于双链形成属于双分子过程，Tm 也随寡核苷酸浓度变化，这就是引物用量不同的反应之间退火表现会有差异的原因。