PCR 计算器
PCR 辅助 —— 退火温度、延伸时间、产物质量和扩增倍数。
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功能简介
PCR 计算器处理实验设计中常见的四类计算：由引物 Tm 推荐退火温度、由产物长度与聚合酶推算延伸时间、由模板拷贝数估算产物质量、以及由循环数与扩增效率计算理论扩增倍数。每种模式只需一到两个输入，适用于配置反应体系或排查问题，但不能替代实际的条件优化。
原理与公式
退火温度模式采用通行经验：取比较低的引物 Tm 再低 3–5 °C，本计算器以 Tm 减 5 °C 作为偏保守的默认值。延伸时间取决于聚合酶的复制速度：时间 = 产物长度（kb）× 速率，Taq 约 60 秒/kb，Pfu 约 120 秒/kb，Q5 或 Phusion 约 30 秒/kb。产物质量按双链碱基对平均质量约 650 道尔顿把分子数换算为质量：质量 = 拷贝数 × 碱基对数 × 650 / 6.022 × 10^23，结果以纳克表示。扩增倍数遵循指数增长：倍数 =（1 + E）^n，n 为循环数、E 为效率，完全倍增时即为 2^n。
演算示例
若两条引物中较低的 Tm 为 60 °C，推荐退火温度为 55 °C。1500 bp 的产物用 Taq 扩增，延伸时间为 1.5 × 60 = 90 秒，即 1 分 30 秒。30 个循环、效率 90% 时扩增倍数为 1.9^30，约 2.3 × 10^8 倍；若完全倍增则为 2^30，约 1.07 × 10^9 倍。以 1000 bp 靶标的 100 万个拷贝为起点，模板本身仅约 0.0011 纳克，这正是必须先扩增才能在凝胶上看到产物的原因。
适用场景
反应没有产物时，先按引物实际 Tm 重新计算退火温度，并在该温度上下几度做梯度，再考虑改动其他条件。从 Taq 换成 Pfu 等高保真酶或 Q5 等快速酶时，重新计算延伸时间，避免长片段被截短或短片段延伸过久。做定量时，用产物质量估算决定凝胶上样体积或下游实验前的稀释倍数；用扩增倍数理解为什么循环数超过约 35 之后，增加的主要是弥散条带和副产物而不是产量。
常见问题
- 怎么根据引物 Tm 计算退火温度？
- 取两条引物中较低的 Tm 再减 3–5 °C，本计算器以减 5 °C 作为稳妥起点。若出现非特异条带，可把退火温度提高到接近或略高于 Tm 以增强严谨性；若完全没有产物则应下调，最好通过温度梯度来确定。
- PCR 的延伸时间该设多久？
- 按产物长度和聚合酶速度换算：Taq 约 1 分钟/kb，Pfu 约 2 分钟/kb，Q5 或 Phusion 约 30 秒/kb。很短的产物仍需保留数秒的最短延伸步骤以便酶完成合成；对长片段或难扩增模板，适当留出余量比把时间压到极限更安全。
- 什么是 PCR 扩增效率，为什么达不到 100%？
- 效率指每个循环中被成功复制的模板分子比例，100% 意味着产物量翻倍。实际反应通常为 80%–95%，原因包括引物退火不完全、二级结构阻碍聚合酶，以及随着循环累积，引物、核苷酸和酶活性逐渐耗尽、产物链之间相互复性，这也是平台期形成的原因。
- PCR 应该跑多少个循环？
- 多数反应 25–35 个循环即可：模板丰富时 25–30 个，模板稀少时可到 35 个。超出之后反应通常已进入平台期，额外循环带来的产物增量有限，却给非特异扩增、引物二聚体和聚合酶错误更多累积时间。