蛋白质等电点计算器
根据氨基酸序列计算蛋白质等电点（pI）。
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功能简介
蛋白质等电点计算器根据氨基酸序列求出多肽的等电点（pI）—— 蛋白质净电荷恰好为零的那个 pH。此时分子在电场中不再定向迁移，溶解度通常也降到最低。生物化学家靠它预测等电聚焦与双向凝胶电泳中的迁移位置、为离子交换层析挑选缓冲液 pH、判断某个纯化步骤会不会让目标蛋白沉淀，以及在改造蛋白时评估增删带电残基造成的后果。本工具除了给出 pI 数值，还一并显示 pH 7 时的净电荷、净电荷随 pH 变化的曲线，以及实际采用的 pKa 常数表。
原理与公式
等电点的计算把所有可解离基团放在一起考虑：N 端 α-氨基、C 端 α-羧基，以及天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）、半胱氨酸（C）、酪氨酸（Y）、组氨酸（H）、赖氨酸（K）、精氨酸（R）的侧链，原则上共九个（序列里没出现的残基自然不参与）。每个基团在给定 pH 下带多少电荷由 Henderson-Hasselbalch 关系式给出 —— 酸性基团按 1/(1+10^(pKa-pH)) 带负电，碱性基团按 1/(1+10^(pH-pKa)) 带正电 —— 把全部基团的分数电荷相加就得到该 pH 下的净电荷。净电荷随 pH 单调递减但没有闭式反函数，所以工具对 pH 做二分搜索，找出净电荷恰好为零的位置，即 pI。端基的 pKa 是残基特异的：N 端在丙氨酸上是 9.8、在半胱氨酸上则是 10.8，因此换一条序列，两端对 pI 的贡献也会变。最后，不同软件默认采用的 pKa 常数集不同，同一个蛋白在不同工具里算出相差零点几的 pI 属于正常现象 —— 本页会把实际用到的每一个常数列在结果下方，便于你判断这个数字能否与手上的实验数据直接比较。
演算示例
以三肽 Lys-Lys-Lys（KKK）为例。三个赖氨酸侧链的 pKa 都是 10.53，N 端 α-氨基的 pKa 为 9.0，C 端 α-羧基为 2.18。在 pH 7 时三条侧链几乎完全质子化、各带 1 个正电，而 C 端早已完全去质子化带 1 个负电，净电荷约为 +3.0。把 pH 逐步调高，侧链逐渐失去质子；当 pH 升到约 10.84 时，三条侧链贡献的正电正好抵消端基的负电与残余的 N 端正电，净电荷归零，这就是它的 pI。换成 Asp-Asp-Asp（DDD）结果完全相反：三个侧链的 pKa 均为 3.65，在 pH 7 时全部去质子化，净电荷约 -3.0，pI 落在 2.49 附近。带六个组氨酸的 His 标签肽（HHHHHH）则居中：侧链 pKa 为 6.0，pH 7 时已部分去质子化，净电荷约 +0.54，pI 约 7.99。这些例子指向同一件事 —— pI 几乎完全由带电残基的种类与数量决定，与序列长短关系不大。
适用场景
选择等电聚焦（IEF）或双向凝胶电泳的 pH 范围时，pI 是首要依据 —— 目标蛋白的 pI 必须落在固相 pH 梯度胶条的区间内，否则它根本不会停留在胶上。用离子交换层析纯化时，工作 pH 至少要与 pI 相差一个单位（阳离子交换取 pH 低于 pI，阴离子交换取 pH 高于 pI），否则蛋白净电荷接近零，结合不上柱子，或者在低盐洗脱时直接沉淀。储存缓冲液与裂解缓冲液遵循同样的规则：把 pH 控制在与 pI 相距一个单位以上的位置，可以明显降低聚集风险。做定点突变时，对比野生型与变体的 pI 能快速发现某个改造意外改变了电荷性质。此外，pI 还能用来解释 SDS-PAGE 上的异常迁移、预测蛋白在特定缓冲液中的溶解度，以及为等电聚焦后切胶回收确定洗脱条件。
常见问题
- 蛋白质等电点如何计算？
- 工具把每一个可解离基团在给定 pH 下的分数电荷相加 —— 包括 N 端 α-氨基、C 端 α-羧基，以及天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸的侧链。净电荷随 pH 单调递减，因此工具对 pH 做二分搜索，找出总和为零的位置，这个 pH 就是 pI。计算所用的 pKa 常数会在结果下方逐条列出。
- 哪些氨基酸对等电点影响最大？
- 天冬氨酸（pKa 3.65）与谷氨酸（4.25）在生理 pH 下完全去质子化，是最主要的负电荷来源，会把 pI 明显拉低；赖氨酸（10.53）与精氨酸（12.48）在生理 pH 下几乎完全质子化，是最主要的正电荷来源，会把 pI 推高。组氨酸（pKa 6.0）的 pKa 靠近生理 pH，只部分带电，影响相对温和。半胱氨酸（8.33）与酪氨酸（10.07）的贡献则取决于溶液 pH 与它们各自 pKa 的距离。
- 这个计算器用哪套 pKa 值？
- 采用一组被广泛使用的标准常数：酸性侧链为 Asp 3.65、Glu 4.25、Cys 8.33、Tyr 10.07，碱性侧链为 His 6.00、Lys 10.53、Arg 12.48。N 端与 C 端的 pKa 是残基特异的 —— N 端在 Ala 上是 9.8、在 Cys 上是 10.8，C 端在 Asp 上是 1.88、在 Leu 上是 2.36。使用其他常数集的工具算出的 pI 可能相差零点几个 pH 单位，所以本页把实际用到的每一个值都列在结果下方。
- pH 7 时的净电荷有什么意义？
- 它直接反映蛋白质在生理条件下的电性：净电荷为正说明它在 pH 7 时会向阴极迁移、在阳离子交换柱上结合较弱；为负则说明它会向阳极迁移、更适合用阴离子交换。数值的大小还说明离等电点有多远 —— 净电荷越接近零，蛋白越容易聚集或沉淀。对于需要在 pH 7 附近操作的实验（细胞裂解、免疫沉淀、多数酶活测定），这个数字往往比 pI 本身更有参考价值。
- 为什么不同软件算出的 pI 不一样？
- 主要有两个原因。第一，pKa 常数集不同：不同来源对同一个基团给出的值可以相差 0.3 到 0.5 个 pH 单位，而这些差异会原样传递到 pI 上。第二，各家对端基与非常规残基的处理方式不同 —— 有的采用固定的 N 端与 C 端 pKa，有的按首尾残基取值；有的把 His 计入碱性残基，有的不考虑。因此同一个蛋白在不同工具里得到相差零点几的 pI 属于正常现象，比较之前应当先确认双方用的是哪一套常数。本页把采用的全部 pKa 值列出，正是为了让这种比较有依据。
- 计算器接受哪些序列格式？
- 单字母代码（MKNFTGALA）与三字母代码都支持，三字母既可以带分隔符（Met-Lys-Asn-Phe），也可以连写（MetLysAsnPhe）。输入中的空白、换行与数字会被忽略。无法识别的片段会列在提示中且不参与计算，这样你不会在不知情的情况下拿到一个基于残缺序列的结果。序列长度没有硬上限，但超过几万残基后，二分搜索会让界面出现短暂停顿。