Sanger 色谱图查看器
打开 .ab1 测序文件，在浏览器中检查四色荧光峰、碱基判读与质量值。
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功能简介
Sanger 色谱图查看器打开一份原始 .ab1 测序文件，向你展示每个碱基判读背后的底层数据：四色荧光色谱、判读出的序列，以及每个碱基的质量值。它是为所有会收到 Sanger 读长的人准备的，无论是检查克隆插入片段的分子生物学家，还是核对引物或突变的技术人员。由于一切都在浏览器中解析，色谱永远不会离开你的电脑。没有上传、没有账号，也没有超出设备能力之外的文件大小限制，因此你可以在实验台旁或野外随时检查读长。
原理与公式
一份 .ab1 文件存储着毛细管测序仪的原始输出。四个染料通道在片段经过检测器时记录荧光：查看器遵循通用惯例，A 为绿色、C 为蓝色、G 为深色、T 为红色。每个通道保存一条色谱，即沿读长采样得到的一串强度值，判读器在某一通道出现峰的位置给出判读。与色谱一起，文件还为每个碱基携带一个质量值，即 Phred 量表的 Q 分值，其中 Q = -10 x log10(错误概率)；Q20 表示判读错误的百分之一概率，Q30 表示千分之一概率。平均信号报告的是某通道的平均强度，可快速反映化学测序的干净程度。
演算示例
假设你打开一份来自质粒插入片段、长度为 900 碱基的读长。查看器报告 900 个碱基、平均质量 39.2，以及 99.1% 的碱基达到或超过 Q20。把窗口滚动到 410 位，你会看到绿色通道（A）中一个明显高于其他三个的干净单峰，确认了该判读，而各通道的平均信号约为 320 到 480 的任意强度单位。在 3' 端约 860 碱基附近，四条色谱趋于重合、质量值降到 20 以下，这正是拼装前应修剪的常规信号。一个杂合位点反而会显示两个高度相当、颜色不同的峰，在这里一目了然，而不会埋没在一串纯文本序列中。
适用场景
当纯文本序列不够、你需要看清某个碱基为何这样判读时，就使用本查看器。它是确认定点突变、核对引物序列是否与其色谱一致，或发现揭示杂合或污染模板的混合峰的最快方式。通过观察质量值降到 20 以下的位点，可在下游拼装前修剪低质量末端。一个常见陷阱是轻信次级峰处的判读序列：当两个通道同时升高时，判读器可能给出 N，此时应当重新跑胶或重新测序，而不是去猜测。另一个陷阱是把起始或末端附近的化学噪声误当成真实变异。
常见问题
- .ab1 文件是什么，能在这里打开吗？
- .ab1 文件是 ABI 毛细管 Sanger 测序仪的原生输出：它包含四条原始荧光色谱、判读的碱基序列，以及每个碱基的 Phred 质量值。本查看器完全在浏览器中解析标准的 ABI/Sanger .ab1 格式，因此无需专用软件就能检查读长。文件从不上传，既保护了序列数据的私密性，也让你能离线工作。
- 四条色谱颜色分别代表什么？
- 每种颜色对应一个核苷酸的荧光通道。查看器采用通用惯例：A 为绿色，C 为蓝色，G 为深色，T 为红色。在某个位置上当某一通道明显高于其他通道时就判读出一个碱基，色谱下方带颜色的字母就是这些判读结果。当两个通道同时出现峰时，说明你看到的是混合或杂合信号，而非干净的单一碱基。
- Phred 质量值是什么意思？
- 质量值 Q 是一个 Phred 分值，Q = -10 x log10(P)，其中 P 是该碱基判读错误的概率。Q20 表示百分之一的出错概率，Q30 表示千分之一。查看器会报告整条读长的平均 Q，以及达到或超过 Q20 的碱基百分比，后者是判断序列是否可信的常用阈值。末端 Q 值偏低属于正常现象，也是需要修剪的信号。
- 如何发现错误或混合的碱基判读？
- 把色谱滚动到相关位置并观察四个通道。可信的判读会显示出明显高出于其他通道的单一峰；混合位点则会显示两个颜色不同、高度相当的峰，判读器往往在那里给出 N。平均信号极低、峰形宽且相互重叠，或质量值骤降，都提示序列不可靠。这类区域应当重新测序，而不是在拼装中轻信它。