CRISPR gRNA 设计器
根据 DNA 序列设计 SpCas9 向导 RNA，带 PAM 与脱靶评分。
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功能简介
CRISPR gRNA 设计器会扫描靶 DNA 序列，寻找 SpCas9 的原间隔序列：紧邻 NGG 原间隔相邻基序 5' 端的 20 个核苷酸间隔序列。对每一处匹配，它报告间隔序列、PAM、链、预测切割位置、GC 含量和脱靶感知分数，并对候选排序，方便你在克隆前挑选向导。基因编辑研究者、检测开发者和学生都用它来获取可用的向导 RNA 序列，而无需安装命令行 CRISPR 软件或跑全基因组比对。
原理与公式
工具沿两条链滑动所选间隔长度的窗口，保留任何 3' 端紧跟 NGG 的 20-mer。PAM 可自定义为其他基序，如用于替代 Cas 蛋白的 NAG 或 TTTV。每条候选从 100 分基线评分：GC 含量每偏离理想值 50% 一个百分点扣 1.2 分；同一间隔序列在基因组中每多出现一次扣 25 分（脱靶风险代理指标）；若含同聚物串（如 AAAAA 或 GGGG）再扣 15 分。剩余分数将向导从最安全排到最危险。
演算示例
取一段 95 bp 的靶序列，含间隔序列 GACCCTGTACGACATGGACT 及其后紧接的 PAM TGG。工具记录 20 nt 间隔序列、TGG PAM、正链，以及 PAM 5' 端约 3 bp 处的切割位点（第 23 位）。其 GC 含量为 55%（20 个碱基中 11 个），即距 50% 差 5 个百分点，故扣 6 分。若同一 20-mer 在基因组中出现两次，分数再降 25。得分高于 70 的向导会被标记为绿色强候选。
适用场景
当你需要敲除、敲入或碱基编辑的向导，且希望避开会在基因组其他地方切割的序列时使用本工具。最大的陷阱是脱靶切割：带数个错配的 20-mer 仍可能切割相近位点，因此优先选得分高于 70 的向导，并用全基因组脱靶搜索验证。避免含同聚物串的间隔序列，它们难以合成且可能丢失。请记住，决定向导效果的是 GC 含量而不仅是 PAM，无 PAM 设计需要工程化 Cas 变体。
常见问题
- SpCas9 需要怎样的 PAM？
- 源自化脓链球菌的 SpCas9 识别 NGG 基序，其中 N 为任意碱基，G 为鸟嘌呤。原间隔序列位于 PAM 紧邻的 5' 端，共 20 个核苷酸，切割发生在 PGG 上游约 3 bp 处。其他 Cas 蛋白使用不同 PAM，例如 SaCas9 需要 NNGRRT，NmeCas9 使用 NNNGATT，因此为这些酶设计向导时要改 PAM 字段。
- gRNA 分数是怎么算的？
- 每条候选序列起始为 100 分。GC 含量每偏离理想值 50% 一个百分点扣 1.2 分，因此 40% 或 60% 的间隔序列会扣 12 分。同一 20-mer 在基因组中每多出现一次扣 25 分，作为脱靶切割的代理指标；若间隔序列含同聚物串（如 AAAAA）再扣 15 分。得分高于 70 的会标记为最强候选。
- 间隔序列该用多长？
- SpCas9 的标准间隔序列为 20 个核苷酸，这是默认值，也是切割最可靠的长度。17-18 nt 的较短序列可提升特异性但削弱切割，22-25 nt 的较长序列扩大靶向范围却增加脱靶风险。滑块设定工具扫描的窗口，除非你有意使用截短或延长的向导，否则保持在 20 nt 附近。
- 如何降低脱靶效应？
- 优先选择得分高于 70 的向导，因为分数已对基因组中重复的 20-mer 进行惩罚。避免含同聚物串和极端 GC 的间隔序列，并用全基因组脱靶搜索验证最终向导，而非只信局部分数。对于敏感编辑，可使用高保真 Cas9 变体如 eSpCas9 或 HiFi Cas9，并考虑用 17-18 nt 截短间隔序列来提高特异性。