引物设计
引物设计工具
由模板与目标区域自动设计 PCR 引物对，按 Tm 匹配度与 GC 含量排序。
模板长度：0 nt
粘贴至少 30 nt 的模板序列才能设计引物。
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功能简介
手工挑引物要同时平衡四件事：两条引物的退火温度、GC 含量、产物长度，以及 5' 端落在哪里。这个工具替你完成这轮搜索。给它一段模板序列和你要扩增的区间，它会返回按评分排序的引物对，可以直接填进订购单。
原理与公式
搜索会在双链上扫描 18–25 nt 的候选引物，要求 3' 端落在目标边界 60 bp 以内——正向引物在目标起点上游，反向引物在目标终点下游。每条候选先按 GC 含量（40–60%）和熔解温度与 60 °C 的接近程度过滤，再按 Tm 偏差、GC 含量，以及末五个碱基里 G/C 的个数打分。3' 端 GC clamp 的打分偏好一到两个 G/C：完全没有会让 3' 端太弱难以起始，全是 G/C 又容易错配。最后对所有正向/反向组合联合打分，返回最优的十对。
演算示例
点「加载示例」——一段 750 bp 的模板，目标区间设为 121–420。排名第一的一对是 5'-CACGCACCTAACAGTCTAAG-3' 与 5'-GTAACTCGCTAGGTTGGGTA-3'，两条都是 20 nt，Tm 59.5 °C、GC 50%，扩增产物 343 bp。正向引物结合在位置 77，反向引物结合在位置 400，扩增子跨越目标区间，两侧都留出了聚合酶装载的空间。
适用场景
可以用来设计菌落 PCR 筛选引物、为克隆扩增一段需要 Tm 匹配的区域，或者抢救那些因为原始引物退火温度不匹配而失败的 PCR。拿到引物对之后，建议先过一遍引物质检工具，排除发夹与 3' 端二聚体再下单。
常见问题
- 这个引物设计工具是怎么挑引物对的？
- 它会在目标区域两侧的双链上扫描 18–25 nt 的候选引物，只保留 GC 含量 40–60%、Tm 与 60 °C 相差 8 °C 以内的序列，再按 Tm 接近度、GC 含量与 3' 端 GC clamp 打分。按总分排序后返回最优的十对。
- 为什么我的目标区域设计不出引物？
- 最常见的原因是目标区间太靠近序列 5' 端——正向引物需要约 60 bp 的上游空间。目标过短也会无解，因为没有引物对能放进产物长度窗口。把目标往序列中段挪，或者放宽区间即可。
- 工具以多少熔解温度为目标？
- 以 60 °C 为目标，容差 ±8 °C。这是两步法 PCR 的常用起点，能让正向与反向引物共用同一个退火温度。若需要更严格的配对，可用 Tm 计算器逐条复核。
- 设计出的引物会检查发夹和二聚体吗？
- 设计阶段不检查。把引物对复制到引物质检工具，即可检测发夹、自身二聚体与交叉二聚体，并在模板上扫描非特异结合位点。