Gibson 的同源臂该多长？

通常 20–40 bp。低于 20 bp 退火不可靠；超过 40 bp 只是增加合成成本而收益有限。高 GC 的接缝建议取偏长的一端。

为什么产物比片段总长要短？

因为每个同源臂被相邻两个片段共享，在产物里只出现一次。有 J 个接缝就会少掉 J 段同源臂的总长。

可以。在插入位点把载体线性化（PCR 或酶切），把它当作其中一个片段，两端各带一段与插入片段同源的序列。

有。组装是方向性的，依赖每个片段与紧邻片段共享同源区，因此你输入的顺序就是产物中的顺序。

按同源重叠拼接 DNA 片段 —— 逐个校验接缝，并导出拼接后的序列。

最小同源臂 (bp)Gibson 通常 20–40 bp 同源臂，默认 30 bp 较稳妥。

片段 1

0 bp

片段 2

0 bp

至少粘贴两个片段，顺序即拼接顺序。

按拼接顺序输入两个或更多线性片段。工具会测量每对相邻片段之间精确的同源长度，把短于下限的接缝标红，并给出无缝拼接产物。

按拼接顺序以 5′→3′ 粘贴片段并逐个命名。高 GC 片段、或三段以上的组装，把最小同源长度提到 30–40 bp。

Gibson 组装在一步等温反应里把带重叠的 DNA 片段连起来：5′ 外切酶把两端回嚼出互补单链，聚合酶补齐缺口，连接酶封闭切口。本计算器做的是序列层面的设计 —— 测量每个接缝的同源长度，给出拼接产物。

对每一对相邻片段，工具会找上游片段 3′ 端与下游片段 5′ 端之间最长的精确匹配。这段共享序列就是同源臂，它在产物中只出现一次，所以产物比输入总长要短。同源臂达到你设定的下限时接缝才算通过 —— 低于约 20 bp 时，重叠区在 50 °C 下无法稳定退火。

250 bp、300 bp、230 bp 三个片段，两处接缝各 30 bp 同源，拼出 700 bp 产物 —— 每个接缝少掉 30 bp。把其中一个同源臂缩到 12 bp，该接缝会变红而另一处仍然通过，这正是原本只能靠跑胶才发现的失败模式。

适合在订购引物前验证 Gibson 设计、预测鉴定酶切的产物大小、以及复核其它工具生成的组装结果。它不建模二级结构、重复序列与酶动力学 —— 接缝报告是设计校验，不是得率预测。

Gibson 的同源臂该多长？: 通常 20–40 bp。低于 20 bp 退火不可靠；超过 40 bp 只是增加合成成本而收益有限。高 GC 的接缝建议取偏长的一端。
为什么产物比片段总长要短？: 因为每个同源臂被相邻两个片段共享，在产物里只出现一次。有 J 个接缝就会少掉 J 段同源臂的总长。
能用 Gibson 把片段插入载体吗？: 可以。在插入位点把载体线性化（PCR 或酶切），把它当作其中一个片段，两端各带一段与插入片段同源的序列。
片段顺序有影响吗？: 有。组装是方向性的，依赖每个片段与紧邻片段共享同源区，因此你输入的顺序就是产物中的顺序。