In-Fusion 与 Gibson 有何不同？

两者都是基于同源区的无缝克隆。In-Fusion 只需约 15 bp，依赖一种带外切酶活性的酶；Gibson 用三种酶，通常需 20–40 bp 同源臂。

能把 PCR 产物直接克隆进载体吗？

可以，这正是它的主要用途。把载体线性化，并在 PCR 引物 5′ 端加上与载体末端同源的 15 bp。

载体通常需要，以去除未切开的模板。粗制 PCR 产物往往也能用，但会提高背景。

说明两端没有共享的精确序列。请检查两条是否都按 5′→3′ 粘贴，以及引物延伸部分是否与目标配对。

用 15 bp 同源臂做无缝克隆 —— 逐个校验接缝并得到重组序列。

最小同源臂 (bp)In-Fusion 约需 15 bp 同源臂，比 Gibson 短。

片段 1

0 bp

片段 2

0 bp

至少粘贴两个片段，顺序即拼接顺序。

In-Fusion 通过 3′→5′ 外切酶暴露出的短同源末端把线性片段连起来。按顺序输入片段，工具会报告每处接缝的同源长度并给出重组产物。

按拼接顺序粘贴片段，每处接缝共享 15 bp。默认下限 15 bp；若某接缝偏 AT-rich，可提到 20 bp。

In-Fusion 克隆用带 3′→5′ 外切酶活性的痘苗病毒 DNA 聚合酶暴露出互补单链突出端，退火后在细胞内被修复。功能上与 Gibson 一样是无缝克隆，但只需约 15 bp 同源区，引物合成成本更低。

工具找出相邻片段之间最长的精确后缀/前缀匹配，再与下限比较。正因为同源区短，匹配必须完全精确 —— 15 bp 同源臂里出现一个错配，比 40 bp Gibson 臂里一个错配的危害大得多。

2.9 kb 线性化载体与 700 bp PCR 产物两端各共享 15 bp，重组得到 3.6 kb 质粒。若其中一个臂订引物时错了一个碱基，接缝报告会显示同源长度为 0，该处判定失败。

适合单片段插入（15 bp 引物比 30 bp 便宜）、无需连接步骤的定点插入，以及在订购寡核苷酸前确认多片段 In-Fusion 设计。

In-Fusion 与 Gibson 有何不同？: 两者都是基于同源区的无缝克隆。In-Fusion 只需约 15 bp，依赖一种带外切酶活性的酶；Gibson 用三种酶，通常需 20–40 bp 同源臂。
能把 PCR 产物直接克隆进载体吗？: 可以，这正是它的主要用途。把载体线性化，并在 PCR 引物 5′ 端加上与载体末端同源的 15 bp。
插入片段需要胶回收吗？: 载体通常需要，以去除未切开的模板。粗制 PCR 产物往往也能用，但会提高背景。
接缝显示同源长度为 0 怎么办？: 说明两端没有共享的精确序列。请检查两条是否都按 5′→3′ 粘贴，以及引物延伸部分是否与目标配对。