重叠延伸 PCR（SOE）工具
用重叠延伸把两个或更多扩增子融合 —— 检查共享重叠区并得到拼接产物。
SOE PCR 通常约 20 bp 重叠，15 bp 是实际下限。
至少粘贴两个片段，顺序即拼接顺序。
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功能简介
重叠延伸 PCR（又称 SOE，splicing by overlap extension）无需酶切位点与连接酶即可融合两个扩增子：内侧引物在一个片段的末端与下一个片段的开头加上同一段序列；循环数轮后重叠链互相退火互为引物，再由外侧引物扩增出完整融合产物。
原理与公式
工具测量前一个片段 3′ 端与后一个片段 5′ 端之间最长的精确匹配 —— 也就是两条链赖以退火的重叠区。达到下限才判定通过；低于约 15 bp 时退火双链太不稳定，无法可靠起始延伸。
演算示例
260 bp 启动子片段与 230 bp 编码片段共享 20 bp，得到 470 bp 融合产物。把共享区缩到 8 bp，接缝判定失败 —— 在管里表现为只有两条输入带、没有融合带。
适用场景
适合给基因加标签、连接两个外显子、构建嵌合体，以及通过融合两侧扩增子来删除中间区段。若片段超过三个，通常商业组装方法更省力。
常见问题
- SOE PCR 需要多长的重叠区？
- 通常约 18–25 bp。低于 15 bp 时重叠区在退火温度下解链、延伸失败；超过 30 bp 收益很小。
- 需要特殊的聚合酶吗？
- 强烈建议用高保真聚合酶，因为整个融合产物都会被扩增，早期引入的错误会复制到最终产物中。
- 能用 SOE PCR 做缺失吗？
- 可以。分别扩增目标区段的上游与下游，让两者带上重叠区再融合，中间的区段就被删除了。
- 为什么只看到两条输入带而没有融合产物？
- 通常是重叠区太短，或片段没有胶回收，导致外侧引物无模板可扩。先检查报告里的重叠长度。