定点突变引物设计工具
为点突变、插入与缺失设计背靠背引物对（Q5 体系），并给出突变后产物序列。
0 bp
坐标为 1 起算闭区间。纯插入令起点 = 终点 + 1；纯缺失把替换序列留空。
粘贴模板序列即可设计引物对。
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功能简介
定点突变用一对背靠背引物扩增整条模板，其中一条携带突变，从而把确定的改变引入质粒。用 DpnI 消化甲基化的亲本模板、再平端连接，即得闭合的突变质粒。
原理与公式
正向引物 = 目标位点上游紧邻的模板碱基 + 替换序列 + 下游紧邻碱基，两侧长度由你设定。反向引物是它的反向互补，两者反向扩增整条质粒。报告中的产物即把目标区间替换后的模板。
演算示例
要把 300 bp 模板的第 12 位由 G 改为 A：起点 = 终点 = 12，替换填 A，侧翼 20 bp。正向引物 = 第 12 位之前的 20 个碱基 + A + 之后的 20 个碱基，共 41 nt，是典型的定点突变引物长度。
适用场景
适合单个残基替换、标签或酶切位点等小片段插入、以及干净的缺失。改动超过约 25 bp 时，建议拆到两条引物上，或改用双片段组装。
常见问题
- 侧翼该多长？
- 突变两侧各有 10–15 bp 完全匹配的模板序列通常足够，引物总长约 25–45 nt。侧翼更长会提高退火温度并增加成本。
- 为什么要用 DpnI 处理？
- 亲本质粒在大肠杆菌中复制因而被甲基化，PCR 产物则没有。DpnI 只切甲基化模板，从而去除野生型背景。
- 能用它做缺失吗？
- 可以。把要删除的区间填进去、替换序列留空，长度变化会显示为负数。
- 插入怎么做？
- 令起点 = 终点 + 1 使区间为空，再填入要插入的序列，产物会正好增加相应长度。