限制酶切分析
对任意 DNA 序列用一种或多种限制酶预测切点、片段大小与凝胶条带。
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功能简介
限制酶切分析工具可预测 II 型限制内切酶在 DNA 序列上的切点以及产生的片段数量。粘贴一段线性或环状序列，选择 EcoRI、BamHI、HindIII 等一种或多种酶，工具会报告每个识别位点、其位置、所得片段大小以及模拟琼脂糖凝胶。它用于分子克隆、质粒作图，以及在订购引物或实际酶切前验证构建体。仅读取标准碱基 A、C、G、T，模糊碱基会被忽略。
原理与公式
限制酶仅在特定的识别序列上切割，该位点通常是 4、6 或 8 bp 长的回文短序列。对每种所选酶，工具扫描 DNA 中该位点的每一次出现并记录切点位置。片段即为相邻切点之间的距离；对于环状分子，首尾切点会首尾相接，因此片段数等于切点数，而线性分子在至少有一个切点时产生切点数加 1 个片段。工具同时列出每种所选酶的缓冲液与最适温度，以便发现不兼容的条件。
演算示例
取 60 bp 的示例质粒，用 EcoRI、BamHI 和 HindIII 酶切。该序列在位置 1 含一个 EcoRI 位点（GAATTC），位置 17 含一个 BamHI 位点（GGATCC），位置 43 含一个 HindIII 位点（AAGCTT）。在环状质粒上这三个切点产生约 16 bp、26 bp、18 bp 三个片段，合计为完整的 60 bp。在线性分子上同样的三个位点产生的片段也约为 16、26、18 bp，只是末端被打开。模拟凝胶按大小在对数刻度上把每个片段显示为一条带。
适用场景
在规划限制克隆步骤、检查质粒在插入片段前是否带有某酶位点，或确认 PCR 产物是否按预期被切开时，使用本工具。选择能在骨架上留下兼容黏性末端的酶。注意两个坑：某个位点可能落在你的目的基因内部并破坏它，且某些酶在甘油或盐浓度异常时会出现星号活性，从而在非特异性位点切割。还要注意，dam、dcm 或 CpG 甲基化的 DNA 会阻断某些酶（如 DpnI），因此要核对宿主菌株。
操作步骤
- 1
粘贴序列
将 DNA 序列粘贴或输入到输入框；非 ACGT 字符会被自动剔除。
- 2
选择酶
勾选常用酶，或在列表中搜索并选择一种或多种用于酶切的限制酶。
- 3
查看切点与片段
在切点表中读取位点与位置，再查看片段大小与下方的模拟凝胶。
- 4
导出或查看
复制片段大小、导出 CSV，或在真实酶切前查看缓冲液与温度冲突。
常见问题
- 限制酶切分析能告诉我什么？
- 它报告你所选每种酶的每个识别位点、从 5′ 端起算的位点 1-based 位置、每种酶的切点数，以及各片段以碱基对计的大小。以 EcoRI 切割 G^AATTC 为例，在 60 bp 线性序列上位置 1 的单一位点产生两个片段，而同一位点在环状分子上产生一个跨越原点的片段。模拟凝胶随后按大小把每个片段排布在对数刻度上。
- 为何环状与线性 DNA 产生的片段数不同？
- 一次切割在这一点把分子断开成片。带有 n 个切点的线性 DNA 形成 n + 1 个片段，因此单一切点得到两段。环状质粒没有游离末端，n 个切点只是把它打开并重新闭合为 n 个片段；单一切点得到的是全长的一条线性片段。因此工具在计算片段大小前会询问你的序列是否为环状。
- 平末端与黏性突出端有何区别？
- 像 EcoRI 这样的酶在两条链上的不同偏移处切割，留下单链的 5′ 或 3′ 突出端，称为黏性末端，可与互补突出端碱基配对。平末端酶（如 SmaI）在两条链同一位置切割，不留下突出端。兼容酶（EcoRI 与 EcoRI）的黏性末端可以连接，而平末端可任意方向连接，但需要更高的 DNA 浓度，通常也需更多连接酶。
- 为何酶不在工具预测处切割？
- 工具仅按序列寻找位点，但实际酶切可能因三个原因失败。甲基化会阻断部分酶：DpnI 只切割甲基化的 GATC，而大肠杆菌中的 Dam 或 Dcm 甲基化可保护某个位点。星号活性会让酶在甘油超过约 5% 或盐浓度错误时切到非特异位点。最后，位点可能隐藏在二级结构内部，因此上机前请用条件表确认。